Культивирование анаэробов осуществляется в условиях повышенного давления

Для культивирования анаэробов необходимо
понизить окислительно-восстановительный
потенциал среды, соз­дать условия
анаэробиоза, т. е. пониженного содержания
кислорода в среде и окружающем ее
пространстве. Это достигается применением
физических, химических и био­логических
методов.

Физические методы. Основаны на
выращивании мик­роорганизмов в
безвоздушной среде, что достигается:

1) посевом в среды, содержащие редуцирующие
и легко окисляемые вещества;

2) посевом микроорганизмов в глубину
плотных пи­тательных сред;

3) механическим удалением воздуха из
сосудов, в ко­торых выращиваются
анаэробные микроорганизмы;

4) заменой воздуха в сосудах каким-либо
индиффе­рентным газом.

В качестве редуцирующих веществ
обычно использу­ют кусочки (около 0,5
г) животных или растительных тканей
(печень, мозг, почки, селезенка, кровь,
картофель, вата). Эти ткани связывают
растворенный в среде кис­лород и
адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить
содер­жание кислорода в питательной
среде, ее перед посевом кипятят 10—15
мин, а затем быстро охлаждают и зали­вают
сверху небольшим количеством стерильного
вазе­линового масла. Высота слоя масла
в пробирке около 1 см.

В качестве легко окисляемых веществ
используют глю­козу, лактозу и
муравьинокислый натрий.

Лучшей жидкой питательной средой
с редуцирующи­ми веществами является
среда Китта — Тароцци, кото­рая
используется с успехом для накопления
анаэробов при первичном посеве из
исследуемого материала и для поддержания
роста выделенной чистой культуры
анаэ­робов.

Посев микроорганизмов в глубину
плотных сред про­изводят по способу
Виньяль — Вейона, который состоит в
механической защите посевов анаэробов
от кислорода воздуха. Берут стеклянную
трубку длиной 30 см и диа­метром 3—6
мм. Один конец трубки вытягивают в
ка­пилляр в виде пастеровской пипетки,
а у другого конца делают перетяжку. В
оставшийся широкий конец трубки вставляют
ватную пробку. В пробирки с расплавленным
и охлажденным до 50°С питательным агаром
засевают исследуемый материал. Затем
насасывают засеянный агар в стерильные
трубки Виньяль — Вейона. Капилляр­ный
конец трубки запаивают в пламени горелки
и трубки помещают в термостат. Так
создаются благоприятные условия для
роста самых строгих анаэробов. Для
выде­ления отдельной колонии трубку
надрезают напильни­ком, соблюдая
правила асептики, на уровне колонии,
ло­мают, а колонию захватывают
стерильной петлей и переносят в пробирку
с питательной средой для дальней­шего
выращивания и изучения в чистом виде.

Удаление воздуха производят путем
его механическо­го откачивания из
специальных приборов — анаэроста-тов,
в которые помещают чашки с посевом
анаэробов. Переносный анаэростат
представляет собой толстостен­ный
металлический цилиндр с хорошо притертой
крыш­кой (с резиновой прокладкой),
снабженный отводящим краном и вакуумметром.
После размещения засеянных чашек или
пробирок воздух из анаэростата удаляют
с помощью вакуумного насоса.

Замену воздуха индифферентным газом
(азотом, во­дородом, аргоном, углекислым
газом) можно производить в тех же
анаэростатах путем вытеснения его газом
из баллона.

Химические методы. Основаны на
поглощении кисло­рода воздуха в
герметически закрытом сосуде (анаэро-стате,
эксикаторе) такими веществами, как
пирогаллол или гидросульфит натрия
Na2S204.

Биологические методы. Основаны на
совместном вы­ращивании анаэробов
со строгими аэробами. Для этого из
застывшей агаровой пластинки по диаметру
чашки вырезают стерильным скальпелем
полоску агара шири­ной около 1 см.
Получается два агаровых полудиска в
одной чашке. На одну сторону агаровой
пластинки засе­вают аэроб, например
часто используют S. aureus
или Serratia marcescens.
На другую сторону засевают ана­эроб.
Края чашки заклеивают пластилином или
заливают расплавленным парафином и
помещают в термостат. При наличии
подходящих условий в чашке начнут
размно­жаться аэробы. После того, как
весь кислород в прост­ранстве чашки
будет ими использован, начнется рост
анаэробов (через 3—4 сут). В целях
сокращения воздуш­ного пространства
в чашке питательную среду наливают
возможно более толстым слоем.

Комбинированные
методы. Основаны на сочетании
фи­зических, химических и биологических
методов создания анаэробиоза.

№ 18 Типы и механизмы питания
бактерий.

Типы питания. Микроорганизмы
нуждают­ся в углеводе, азоте, сере,
фосфоре, калии и других элементах. В
зависимости от источников углерода для
питания бактерии делятся на аутотрофы,
использующие для построения своих
клеток диоксид углерода С02 и
другие неорганические соединения, и
гетеротрофы, питающиеся за счет
готовых органических соединений.
Аутотрофными бактериями являются
нитрифицирующие бактерии, находящиеся
в почве; серобактерии, обитающие в воде
с сероводородом; железобак­терии,
живущие в воде с закисным железом, и др.

Гетеротрофы, утилизирующие
органические остатки отмерших организмов
в окружающей среде, называются сапрофитами.
Гетеротрофы, вызывающие заболевания у
человека или живот­ных, относят к
патогенным и условно-патогенным. Среди
пато­генных микроорганизмов встречаются
облигатные и фа­культативные паразиты
(от греч. parasitos — нахлебник).
Облигатные паразиты способны существовать
только внутри клетки, например риккетсии,
вирусы и некоторые простейшие.

В зависимости от окисляемого субстрата,
называемого доно­ром электронов или
водорода, микроорганизмы делят на две
группы. Микроорганизмы, использующие
в качестве доноров во­дорода
неорганические соединения, называют
литотрофны-ми (от греч. lithos
— камень), а микроорганизмы, использую­щие
в качестве доноров водорода органические
соединения, — органотрофами.

Учитывая источник энергии, среди
бактерий различают фототрофы, т.е.
фотосинтезирующие (например, сине-зеленые
во­доросли, использующие энергию
света), и хемотрофы, нуж­дающиеся в
химических источниках энергии.

Механизмы питания. Поступление
различных веществ в бак­териальную
клетку зависит от величины и растворимости
их мо­лекул в липидах или воде, рН
среды, концентрации веществ, различных
факторов проницаемости мембран и др.
Клеточная стенка пропускает небольшие
молекулы и ионы, задерживая мак­ромолекулы
массой более 600 Д. Основным регулятором
поступ­ления веществ в клетку является
цитоплазматическая мембрана. Условно
можно выделить четыре механизма
проникновения пи­тательных веществ
в бактериальную клетку: это простая
диффу­зия, облегченная диффузия,
активный транспорт, транслокация групп.

Наиболее простой механизм поступления
веществ в клетку — простая диффузия,
при которой перемещение веществ
про­исходит вследствие разницы их
концентрации по обе стороны
цитоплазматической мембраны. Вещества
проходят через липид-ную часть
цитоплазматической мембраны (органические
молеку­лы, лекарственные препараты)
и реже по заполненным водой каналам в
цитоплазматической мембране. Пассивная
диффузия осуществляется без затраты
энергии.

Облегченная диффузия происходит
также в результате разницы концентрации
веществ по обе стороны цитоплазмати­ческой
мембраны. Однако этот процесс осуществляется
с помо­щью молекул-переносчиков,
локализующихся в цитоплазматичес­кой
мембране и обладающих специфичностью.
Каждый перенос­чик транспортирует
через мембрану соответствующее вещество
или передает другому компоненту
цитоплазматической мембра­ны —
собственно переносчику. Белками-переносчиками
могут быть пермеазы, место синтеза
которых — цитоплазматичес­кая
мембрана. Облегченная диффузия протекает
без затраты энер­гии, вещества
перемещаются от более высокой концентрации
к более низкой.

Активный транспорт происходит с
помощью пермеаз и направлен на перенос
веществ от меньшей концентрации в
сто­рону большей, т.е. как бы против
течения, поэтому данный про цесс
сопровождается затратой метаболической
энергии (АТФ), образующейся в результате
окислительно-восстановительных ре­акций
в клетке.

Перенос (транслокация) групп сходен
с активным транспортом, отличаясь тем,
что переносимая молекула видо­изменяется
в процессе переноса, например
фосфорилируется.

Выход
веществ из клетки осуществляется за
счет диффузии и при участии транспортных
систем.

№ 19 Основные принципы
культивирования бактерий.

Универсальным инструментом для
производства посевов явля­ется
бактериальная петля. Кроме нее, для
посева уколом при­меняют специальную
бактериальную иглу, а для посевов на
чашках Петри — металлические или
стеклянные шпатели. Для посевов жидких
материалов наряду с петлей используют
пасте­ровские и градуированные
пипетки. Первые предварительно
из­готовляют из стерильных легкоплавких
стеклянных трубочек, которые вытягивают
на пламени в виде капилляров. Конец
ка­пилляра сразу же запаивают для
сохранения стерильности. У пастеровских
и градуированных пипеток широкий конец
за­крывают ватой, после чего их помещают
в специальные пеналы или обертывают
бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры
берут пробирку в левую руку, а правой,
обхватив ватную пробку IV
и V пальцами, вынимают ее,
пронося над пламенем горелки. Удерживая
дру­гими пальцами той же руки петлю,
набирают ею посевной ма­териал, после
чего закрывают пробирку пробкой. Затем
в пробирку со скошенным агаром вносят
петлю с посевным материалом, опуская
ее до конденсата в нижней ча­сти среды,
и зигзагообразным движением распределяют
мате риал по скошенной поверхности
агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки
и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют
в пламени горелки и ставят в штатив.
Пробирки с посевами надг писывают,
указывая дату посева и характер посевного
мате­риала (номер исследования или
название культуры).

Посевы
«газоном» производят шпателем на
питательный агар в чашке Петри. Для
этого, приоткрыв левой рукой крышку,
пет­лей или пипеткой наносят посевной
материал на поверхность питательного
агара. Затем проводят шпатель через
пламя горел­ки, остужают его о внутреннюю
сторону крышки и растирают материал по
всей поверхности среды. После инкубации
посева появляется равномерный сплошной
рост бактерий.

№ 20 Искусственные питательные
среды, их классификация. Требования,
предъявляемые к питательным средам.

Питательной средой в микробиологии
называют среды, содер­жащие различные
соединения сложного или простого
состава, которые применяются для
размножения бактерий или других
микроорганизмов в лабораторных или
промышленных условиях.

Питательные среды готовят из
продуктов животного или рас­тительного
происхождения. Большое значение имеет
наличие в питательной среде ростовых
факторов, которые катализируют
метаболические процессы микробной
клетки (витамины груп­пы В, никотиновая
кислота и др.).

Искусственные среды готовят по
определенным рецептам из различных
настоев или отваров животного или
растительного про­исхождения с
добавлением неорганических солей,
угле­водов и азотистых веществ.

В бактериологической практике чаще
всего используют сухие питательные
среды, которые получают на основе
достижений современной биотехнологии.
Для их приготовления используют
экономически рентабельное непищевое
сырье: утратившие срок годности
кровезаменители (гидролизин—кислотный
гидролизат крови животных, аминопептид
— ферментативный гидролизат крови;
продукты биотехнологии (кормовые дрожжи,
кормовой лизин, виноградная мука,
белколизин). Сухие питательные среды
могут храниться в течение длительного
времени, удобны при транспортировке и
имеют относительно стандартный состав.

По консистенции питательные среды
могут быть жид­кими, полужидкими,
плотными. Плотные среды готовят путем
до­бавления к жидкой среде 1,5—2% агара,
полужидкие — 0,3— 0,7 % агара. Агар
представляет собой продукт переработки
осо­бого вида морских водорослей, он
плавится при температуре 80—86 °С,
затвердевает при температуре около 40
°С и в застыв­шем состоянии придает
среде плотность. В некоторых случаях
для получения плотных питательных сред
используют желатин (10—15%). Ряд естественных
питательных сред (свернутая сы­воротка
крови, свернутый яичный белок) сами по
себе являются плотными.

По целевому назначению среды
подразделяют на основные, элективные
и дифференци­ально-диагностические.

К основнымотносятся среды,
применяемые для выращивания многих
бактерий. Это триптические гидролизаты
мясных, рыбных продуктов, крови животных
или казеина, из которых готовят жидкую
среду — питательный бульон и плотную
— пита­тельный агар. Такие среды
служат основой для приготов­ления
сложных питательных сред — сахарных,
кровяных и др., удовлетворяющих пищевые
потребности патогенных бак­терий.

Элективныепитательные среды
предназначены для избира­тельного
выделения и накопления микроорганизмов
определен­ного вида (или определенной
группы) из материалов, содержа­щих
разнообразную постороннюю микрофлору.
При создании элективных питательных
сред исходят из биологических
особен­ностей, которые отличают данные
микроорганизмы от большин­ства других.
Например, избирательный рост стафилококков
на­блюдается при повышенной концентрации
хлорида натрия, хо­лерного вибриона
— в щелочной среде и т. д.

Дифференциально-диагностическиепитательные среды при­меняются для
разграничения отдельных видов (или
групп) мик­роорганизмов. Принцип
построения этих сред основан на том,
что разные виды бактерий различаются
между собой по биохи­мической активности
вследствие неодинакового набора
фермен­тов.

Особую группу составляют синтетические
и полусинтетиче­ские питательные
среды. В состав синтетических сред
входят химически чистые вещества:
аминокислоты, минеральные соли, углеводы,
витамины. В полусинтетические среды
дополнительно включают пептон, дрожжевой
экстракт и другие питательные вещества.
Эти среды чаще всего применяют в
научно-исследова­тельской работе и
в микробиологической промышленности
при получении антибиотиков, вакцин и
других препаратов.

В последние годы в целях экономии
питательных сред и уско­ренной
идентификации некоторых микроорганизмов
(энтеробактерии, стафилококки, стрептококки
и др.) применяются так на­зываемые
микротест-системы(МТС).
Они представляют собой полистироловые
пластины с лунками, в которых содержатся
сте­рильные дифференциально-диагностические
среды. Стерилизацию МТС проводят
УФ-облучением. Микротест-системы особенно
удобны при массовых бактериологических
исследованиях в практических лабораториях.