Артериальное давление у мышей

Apelin elevates blood pressure in ICR mice with L-NAME-induced endothelial dysfunction
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3658861/

Apelin является эндогенным лигандом APJ, который принадлежит к семейству G-связанных с белком рецепторов. Apelin и APJ высоко экспрессируются в различных сердечно-сосудистых тканях, включая сердечные, почки и сосудистые эндотелиальные и гладкомышечные клетки. Хотя апелин оказывает гипотензивное действие посредством активации эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS), способность апелина регулировать кровяное давление в патологических условиях плохо изучена. В текущем исследовании метиловый эфир NG-нитро-L-аргинина (L-NAME), мощный ингибитор NOS, вводили хронически, чтобы индуцировать периферическое повреждение сосудов у мышей. Обработанные L-NAME мыши проявляли гипертонию, повышали уровень адгезии клеток-1 сосудистых клеток и уровень мРНК ингибитора 1 плазминогена в аорте и нарушали сосудорасширение, связанное со сниженной экспрессией eNOS аорты, в соответствии с повреждением эндотелия. Через три дня после отмены лечения L-NAME оценивали реакцию артериального давления на стимуляцию апелином. Хотя apelin уменьшало артериальное давление у необработанных мышей, было обнаружено, что при мышах, обработанных L-NAME, мы временно повышаем кровяное давление. Эти результаты показывают, что апелин функционирует как вазопрессорный пептид в патологических состояниях, включая сосудистую эндотелиальную дисфункцию у мышей.

Первоначально Apelin был идентифицирован в бычьем желудке как эндогенный пептидный лиганд APJ-рецептора, который относится к семейству рецепторов, связанных с белком G (1). Apelin и APJ выражены в различных сердечно-сосудистых тканях, включая сердечные, почки и сосудистые эндотелиальные и гладкомышечные клетки (2). Было показано, что Apelin вызывает гипотензивные эффекты посредством активации эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS) в сосудистых тканях (3). Кроме того, мы ранее показали, что APJ участвует в зависимости от апелин-зависимой гипотензивной активности и активации эндотелиального NOS (eNOS) с использованием APJ-дефицитных мышей (4). Поэтому было выдвинуто предположение, что апелин функционирует как сосудорасширяющий аппарат в стационарных условиях.

С другой стороны, сообщалось также, что апелин заключает подкожные вены, из которых эндотелий был физически удален ex vivo (5) и фосфорилирует миозиновую легкую цепь, ограничивающее скорость событие для сосудистого сужения, в культивируемых сосудистых гладкомышечных клетках (6) , Несмотря на то, что было предложено функционировать в качестве сосудосуживающего средства, было установлено, что его вазоконстриктивные свойства эффективны при гомеостазе артериального давления.

В текущем исследовании апелин-зависимые эффекты на кровяное давление были проанализированы во время сосудистой эндотелиальной дисфункции, наиболее распространенного предрасполагающего фактора при различных сердечно-сосудистых заболеваниях, включая гипертонию, тромб, инсульт, почечную недостаточность и сердечную недостаточность (7,8). Чтобы индуцировать повреждение эндотелия сосудов у мышей, хронически вводили хронически вводимый метиловый эфир NG-нитро-L-аргинина (L-NAME), мощный ингибитор NOS (9-11). Обработанные L-NAME мыши имели гипертензию, повышенную экспрессию генов, связанных с эндотелиальной дисфункцией, и нарушение сосудорасширения. В этих условиях было обнаружено, что апелин временно повышал кровяное давление у мышей, обработанных L-NAME, хотя гипотензивный эффект наблюдался у необработанных мышей. Эти результаты показывают, что апелин обладает патофизиологической ролью у мышей с эндотелиальной дисфункцией.

Эксперименты с животными проводили с использованием 2-месячных мышей ICR-мужчин в сознательных и безудержных условиях. L-NAME (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) вводили, как описано выше (12). Вкратце, L-NAME суспендировали в воде (1 мг / мл) и мышам разрешалось свободно пить в течение 1 месяца. Вода, содержащая L-NAME, заменялась каждую неделю. После лечения L-NAME бутылка была заменена на нормальную воду в течение 3 дней, чтобы позволить L-NAME выводиться с мышей. Во всех экспериментах использовались контрольные мыши, ориентированные на возраст и пол. Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по экспериментальному эксперименту животных Университета Цукубы. Эксперименты проводились в соответствии с Постановлением об экспериментах животных Университета Цукубы и Основными принципами надлежащего проведения экспериментов на животных и связанной с ними деятельностью в академических исследовательских институтах, находящихся под юрисдикцией Министерства образования, культуры, спорта, науки и техники, Япония.

Аорты вырезали у мышей, периваскулярные липиды удаляли и аорты быстро замораживали в жидком азоте. Общая РНК была выделена из аорты с использованием комплекта изоляционных комплексов RNAgents Total RNA (Promega Corporation, Мэдисон, штат Висконсин, США). Вкратце, замороженные аорты измельчали ​​до порошка с использованием Multi-Beads Shocker (Yasui Kikai Corporation, Osaka, Japan), суспендировали в денатурирующем растворе и тщательно перемешивали с фенольным хлороформом. Смесь центрифугировали (14 000 об / мин при 4 ° С в течение 20 мин) для сбора супернатанта, после чего добавляли Ethachinmate (Nippon Gene Co., Ltd., Tokyo, Japan). Наконец, общую РНК собирали, используя метод осаждения этанолом.

Общая РНК (~ 1 мкг) была обратной транскрипции с использованием набора QuantiTect для обратной транскрипции (Qiagen, Hilden, Germany), а затем количественная ПЦР в реальном времени была выполнена с использованием термальных циклеров и SYBR Premix ExTaq II. Относительная экспрессия гена определялась методом ΔΔCt. Для амплификации использовали следующие праймеры: GAPDH, 5′-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3 ‘и 5′-TTG CTG TTG AAG TCG CAG GAG-3′; молекула адгезии сосудистых клеток-1 (VCAM-1), 5’-TGA ACC CAA ACA GAG GCA GAG-3 ‘и 5′-GGT ATC CCA TCA CTT GAG CAG-3′; ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1), 5’-TCA GGA TCG AGG TAA ACG AG-3 ‘и 5′-TGA AGA GGA TTG TCT CTG CG-3′; Tie2, 5’-CTG AGA ACA ACA TAG GAT CAA GCA A-3 ‘и 5′-AAC AGC ACG GTG ATG CAA GTC-3′; eNOS, 5’-AAT TAA TGT GGC CGT GTT GCA-3 ‘и 5′-GCT CAT TTT CCA GGT GCT TCA-3′; CD31, 5’-AGG TGT GCG AAA TGC TCT CG-3 ‘и 5′-AAG GAA GAC TCT GAC TGC AAG-3′; CD31, 5’-AGG TGT GCG AAA TGC TCT CG-3 ‘и 5′-AAG GAA GAC TCT GAC TGC AAG-3′; APJ, 5’-CCT TCT AGG TGT GCC TGT CAT G-3 ‘и 5′-CAC TGG ATC TTG GTG CCA TTT-3’.

Мышей анестезировали изофлураном, а грудные кольца аорты вырезали в ледяном буфере Кребса-Хенселейта (NaCl, 118, KCl, 4,7, CaCl 2, 1,8, NaH 2 PO 4, 1,8, MgSO 4, 1,2, NaHCO 3, 25 и глюкозе, 11,1). Кольца были разрезаны на 3-миллиметровые секции и установлены в системе Easy Magnus (Kishimoto Medical Instruments, Киото, Япония). Установленным кольцам давали возможность уравновешиваться в течение 60 мин при пассивном натяжении 35 мН в буфере Кребс-Хенсейт, газированном 95% О2 / 5% СО2 при 37 ° С. В течение следующего часа натяжение покоя увеличивалось вдвое до 60 мМ KCl и один раз до 80 мМ для оптимизации сужения. Кольца предварительно сжимались с норадреналином [L — (-) — норэпинефрином — (+) — битартратом; Calbiochem, La Jolla, CA, USA] для достижения 20-30% максимального тона. Вазодилатацию измеряли при повышении концентрации ацетилхолина (Ach; ​​Sigma-Aldrich). После добавления каждой концентрации Ach последующая доза не добавлялась до восстановления базовой линии.

Систолическое артериальное давление измеряли с использованием программируемого сфигмоманометра (BP-200, Softron Co. Ltd., Токио, Япония) с использованием метода хвостовой манжеты, как описано ранее (13). Перед измерением проводили 2-дневный предварительный осмотр, и мышам было знакомо с сфигмоманометром. Неанестезированных мышей вводили в держатель, установленный на термостатически регулируемой нагревательной пластине и поддерживали при 37 ° C на протяжении всего измерения. Апелин вводили внутрибрюшинно, в то время как мыши были сознательными и безудержными. [Pyr1] -apelin-13 (Peptide Institute, Inc., Osaka, Japan) суспендировали в физиологическом растворе (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan). После измерения базального систолического артериального давления [Pyr1] -apelin-13 вводили внутрибрюшинно при 296 мкг / кг массы тела. Систолическое артериальное давление измерялось непрерывно в течение ~ 5 мин, и данные собирались каждые 20 секунд.

Статистическое сравнение было выполнено с использованием GraphPad Prism версии 5 для Macintosh (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США). Студенческие t-тесты или тесты Манна-Уитни U были адаптированы для оценки значимости различий между группами. P

Было показано, что гипертония, индуцированная L-NAME у мышей, увеличивает повреждение периферических органов, в том числе сосудистую эндотелиальную дисфункцию (14). Чтобы оценить апелинозависимую регуляцию артериального давления во время эндотелиального повреждения, повреждение сосудов было вызвано у мышей обработкой L-NAME. После введения L-NAME в питьевой воде в течение 1 месяца измеряли массу тела и кровяное давление необработанных и обработанных L-NAME мышей. Масса тела обработанных L-NAME мышей не отличалась от массы необработанных контрольных мышей (фиг.1А). Напротив, было обнаружено, что артериальное давление группы, обработанной L-NAME, значительно увеличивается на ~ 20-30 мм рт.ст. (фиг.1В, замкнутые круги).

Для оценки влияния L-NAME на сосудистую травму оценивали уровни экспрессии различных маркеров повреждения эндотелия, включая VCAM-1 (15) и фактор регуляции фибринолитической системы PAI-1 (16,17). Как показано на фиг.2, уровни мРНК VCAM-1 и PAI-1 были значительно увеличены в аортах, полученных из группы, обработанной L-NAME, по сравнению с уровнями контроля (фиг.2А и В). Кроме того, были определены уровни экспрессии генов Tie2 и eNOS, маркер сосудистых эндотелиальных клеток и важный сосудорасширяющий фактор. Хотя экспрессия гена Tie2 в обработанных L-NAME аортах и ​​контрольных аортах не различалась, экспрессия гена eNOS была идентифицирована как значительно уменьшенная у мышей, обработанных L-NAME, по сравнению с контрольными (фиг.2C и D).

Известно, что гипертензия и сосудистая эндотелиальная дисфункция являются основными причинами нарушенной вазодилатации (15). Следовательно, индуцированную ацетилхолином вазодилатационную активность аорты, полученную от мышей, обработанных L-NAME, оценивали с использованием анализа ex vivo. Кольца аорты из контрольной группы были полностью расширены в дозе 10-6 М ацетилхолина (фиг.2Е, открытые круги). Напротив, кольца аорты, из которых физически удалялись эндотелиальные клетки, реагировали минимально на ацетилхолин (фиг.2Е, замкнутые круги). Для обработанных L-NAME аортальных колец наблюдалась ацетилхолин-индуцированная сосудистая дилатация дозозависимым образом, однако максимальная вазодилатация не достигалась полностью (рис. 2Е, закрытые квадраты). Рис. 1 и 2 подтвердили, что эндотелиальные клетки оставались структурно неповрежденными, но функционально повреждены, как описано ранее (18).

Чтобы исследовать влияние апелина на артериальное давление, апелин вводили мышам, которые не лечили или лечили L-NAME. У необработанных мышей введение apelin временно уменьшало артериальное давление по сравнению с эффектом солевого раствора (фиг.3А, заполненные круги). Однако следует отметить, что кровяное давление было временно увеличено у обработанных L-NAME мышей, и степень повышенного кровяного давления была значительно выше, чем у контрольных мышей с физиологическим раствором (фиг.3А, заполненные квадраты).

Наконец, из-за его важности в опосредованной аполином гипертонии, экспрессия APJ в аорте была исследована с использованием RT-PCR. Несмотря на то, что уровень экспрессии CD31, маркера эндотелиальных клеток, был значительно снижен путем мягкого трения поверхности интимы аорты (фиг.3B), экспрессия гена APJ была сохранена в аорте (фиг.3C). Эти результаты показывают, что APJ также экспрессируется в клетках гладкой мускулатуры, где он может регулировать изменения чувствительности к апелину после лечения L-NAME.

Хорошо известно, что системное введение апелинов высвобождает сосудорасширяющие вещества, включая NO, и снижает артериальное давление (3,4). В настоящем исследовании важность апелина для регулирования артериального давления в патологических условиях была проанализирована хронически лечащими мышами L-NAME (фиг.1), аналоговой молекулой асимметричного диметилгинина (ADMA), которая индуцирует повреждение эндотелия, одно наиболее серьезных факторов при различных сердечно-сосудистых заболеваниях (7,8). L-NAME, подобно ADMA, ингибирует продукцию NO, подавляя ферментативную активность eNOS и индуцирует сосудистую эндотелиальную дисфункцию, сопровождающуюся гипертонией (14). В этих условиях мыши, обработанные L-NAME, были подтверждены гипертонией, повышенными уровнями экспрессии генов, связанных с эндотелиальной дисфункцией, и нарушенной вазодилатации (фиг.1 и 2).

Лечение L-NAME не влияло на уровни экспрессии гена Tie2, маркера сосудистых эндотелиальных клеток (фиг.2C), что указывает на то, что эндотелиальные клетки были сохранены поврежденными сосудистыми стенками (фиг.2A и B). Напротив, лечение L-NAME уменьшало уровни мРНК eNOS (рис. 2D). Ранее сообщалось, что уровни экспрессии гена eNOS снижаются при введении L-NAME в ткани аорты крысы (18). Это наблюдение согласуется с результатами настоящего исследования, и снижение биодоступности NO и ускоренных патологических состояний может быть связано с нарушенной вазодилатацией (фиг.2E), связанной с повреждением эндотелия.

Было обнаружено, что в этом патологическом состоянии было обнаружено, что введение apelin вызывает вазопрессорный ответ, тогда как он снижает кровяное давление необработанных мышей (фиг.3А). Гипертоническое действие L-NAME у мышей может опосредовать прямые сосудосуживающие эффекты апелина на гладкие мышцы сосудов, поскольку экспрессия APJ была обнаружена в тканях аортальной мыши, из которых были удалены эндотелиальные клетки (фиг.3B и C). Ранее сообщалось, что апелин проходит через поврежденный ADMA эндотелиальный барьер из-за его повышенной проницаемости, что оценивается с помощью анализа in vitro (19). Возможно, что апелин получает доступ к сосудистым клеткам гладкой мускулатуры при повреждении эндотелия и сжимает эти клетки.

В заключение, результаты настоящего исследования показывают, что лечение апилином у мышей влияет на кровяное давление в тех случаях, когда артериальное давление, которое является относительно низким при нормальных условиях, повышается при патологических состояниях, которые индуцируются эндотелиальной дисфункцией in vivo. Таким образом, предполагается, что защита от повреждения эндотелия не только требуется для образования NO, но также для предотвращения действия биологических веществ, которые сжимают сосуды. В этом отношении результаты настоящего исследования дают более подробное представление и более глубокое понимание сложностей регулирования артериального давления апелином.

Авторы благодарят членов Лаборатории Fukamizu за их полезные обсуждения и поддержку. Исследование было поддержано грантами для научных исследований (B), грантами для помощи молодым ученым (B), грантами для помощи стипендиатам JSPS из Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии и грантов в помощь научным сотрудникам Японского общества содействия науке.

(A) Масса тела и (B) систолическое артериальное давление контрольных и мышей, обработанных L-NAME. Каждый параметр измеряли через 0, 5, 10, 15 и 30 дней после начала лечения. Данные представляют среднее значение ± SEM. Каждая группа, n = 5-8. * P

Оценка сосудистой эндотелиальной дисфункции. (A-D) Анализ экспрессии генов маркеров сосудистой эндотелиальной дисфункции. (A) VCAM-1, (B) PAI-1, (C) Tie2 и (D) уровни мРНК eNOS были количественно оценены ПЦР в реальном времени. Каждая группа, n = 4-5 и * P

Вазопрессорное действие апелина у мышей, обработанных L-NAME. (A) Временной ход чередования артериального давления после внутрибрюшинной инъекции [Pyr1] -apelin-13. Артериальное давление на исходном уровне измеряли в течение ~ 100 с перед введением апелинов. После инъекции апелина измерения продолжались в течение ~ 300 секунд. Каждая группа, n = 3-4. * P